谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性測(cè)定試劑盒說明書
微量法 100管/96樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
GLS（EC 3.5.1.1）是酰胺基水解酶，催化天冬酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代謝中具有重要調(diào)控作用，尤其是調(diào)節(jié)游離氨含量和尿素代謝。
測(cè)定原理：
GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏試劑檢測(cè)氨增加的速率，即可計(jì)算其酶活性。
需自備儀器和用品：
臺(tái)式離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽、冰和雙蒸水。
試劑組成和配制：
試劑一×2瓶，60 mL，4 ℃保存；
試劑二×1瓶，40 mL，4 ℃保存；
試劑三×1瓶，60 mL，常溫保存；
試劑四×1瓶，5 mL，常溫保存；
試劑五×1瓶，3 mL，常溫保存；
試劑六×1瓶，3 mL，常溫避光保存。
粗酶液提取：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至420nm。
2、樣品測(cè)定（在EP管中加入下列試劑）：
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試劑名稱（μL） |
測(cè)定管 |
對(duì)照管 |
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樣本 |
25 |
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蒸餾水 |
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25 |
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試劑一 |
100 |
100 |
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試劑二 |
400 |
400 |
混勻，37℃水浴1 小時(shí)
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試劑三 |
525 |
525 |
混勻，8000 g，25℃離心10 min；取上清液，在96孔板中加入下列試劑
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上清液 |
130 |
130 |
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試劑四 |
30 |
30 |
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試劑五 |
20 |
20 |
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試劑六 |
20 |
20 |
混勻，室溫靜置15min，420nm處讀取測(cè)定管和對(duì)照管吸光值，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。對(duì)照管只要做一管。
注意：
1、試劑六如出現(xiàn)沉淀，靜置后取上清使用。
2、ΔA（A測(cè)定管-A對(duì)照管）若出現(xiàn)負(fù)值，可能是酶活性較低，可將反應(yīng)時(shí)間1h延長到2h，相應(yīng)的在計(jì)算公式中除以2。
酶活性計(jì)算：
標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 1.9244x + 0.0057，R2 = 0.9983；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值A(chǔ)。
1、血清（漿）GLS活性
單位定義：每mL血清（漿）每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。GLS(nmol /min /mL)＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反總÷V樣÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞GLS活性
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位定義：每mg蛋白質(zhì)每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。
GLS(nmol /min /mg prot)＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷Cpr。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每g組織每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。
GLS(nmol/min /g 鮮重)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷W。
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。GLS(nmol/min/104 cell)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ÷T ×1000 =0.7274×(ΔA -0.0057)
V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，60min；V反總：反應(yīng)體系總體積，1.05mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.025mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬; 1000，μmol到nmol換算系數(shù)。
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資料/datasheet
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