亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）試劑盒說(shuō)明書
微量法100T/48S
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義
硝酸還原酶（NiR）是一類能催化亞硝酸鹽還原的酶，廣泛存在于微生物及植物體內(nèi)，是自然界氮循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，可以將亞硝酸鹽降解為NO或NH3，從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累，降低因亞硝酸鹽累積而造成的對(duì)生物體的毒害作用。
測(cè)定原理
亞硝酸還原酶可將NO2—還原為NO，使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO2—減少，即540nm處吸光值的變化可反映亞硝酸還原酶的活性。
需自備的儀器和用品
天平、研缽、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、水浴鍋、低溫離心機(jī)。
試劑的組成和配制
提取液：液體112mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體4mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加5mL蒸餾水溶解。
試劑三：液體5mL×1瓶，4℃保存。（如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解）
試劑四：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。（如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解）
試劑五：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。
工作液：臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以1:1的比例混合。
酶液提取
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2．細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
測(cè)定操作表
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空白管 |
對(duì)照管 |
測(cè)定管 |
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樣本（μL） |
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20 |
20 |
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蒸餾水（μL） |
20 |
40 |
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試劑一（μL） |
40 |
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40 |
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試劑二（μL） |
40 |
40 |
40 |
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混勻后，25℃反應(yīng)1h |
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試劑三（μL） |
40 |
40 |
40 |
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充分震蕩30S |
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上清液（μL） |
70 |
70 |
70 |
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工作液（μL） |
140 |
140 |
140 |
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充分混勻，，靜置3min后測(cè)定各管540nm處吸光值，分別記為A空白管、A對(duì)照管、A測(cè)定管?？瞻坠苤灰鲆还?，每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。 |
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計(jì)算公式
a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.3594x + 0.0072，R2 = 0.9997；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）。
1．按照蛋白含量計(jì)算
酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時(shí)還原1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。
NiR（μmol/h /mg prot）= [A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V標(biāo)÷（V樣×Cpr）÷T = 1.47×（A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072）÷Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活單位定義：每克組織每小時(shí)還原1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。
NiR（μmol/h/g 鮮重）=[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V標(biāo)÷（W ×V樣÷V樣總）÷T = 1.47×（A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072）÷W
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活單位定義：每104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)還原1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。
NiR（μmol/h /104 cell）= [A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V標(biāo)÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T = 1.47×（A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072）÷細(xì)胞數(shù)量
V標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.04mL；V樣：體系中加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質(zhì)量，g
b. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.6797x + 0.0072，R2 = 0.9997；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）。
1．按照蛋白含量計(jì)算
酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時(shí)還原1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。
NiR（μmol/h /mg prot）= [A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷0.6797×V標(biāo)÷（V樣×Cpr）÷T = 2.94×（A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072）÷Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活單位定義：每克組織每小時(shí)還原1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。
NiR（μmol/h/g 鮮重）=[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷0.6797×V標(biāo)÷（W ×V樣÷V樣總）÷T = 2.94×（A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072）÷W
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活單位定義：每104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)還原1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。
NiR（μmol/h /104 cell）= [A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷0.6797×V標(biāo)÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T = 2.94×（A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072）÷ 細(xì)胞數(shù)量
V標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.04mL；V樣：體系中加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質(zhì)量，g
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