4-香豆酸：輔酶A連接酶（ 4-coumarate:CoA ligase，4CL)
試劑盒說明書
微量法 100管/48樣
正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
4CL是連接苯丙酸途徑與木質素特異合成途徑的關鍵酶，主要催化肉桂酸生成相應的肉桂酸輔酶A酯，是合成木質素與其他苯丙烷類化合物的代謝流向調控點。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細胞發(fā)育過程中木質素沉積的代謝機理，為減少水果石細胞含量而提高其品質提供依據(jù)。
測定原理：
4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA，在333nm下測4-香豆酸CoA生成速率，即可反映4CL活性。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：100mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體25 mL×1瓶， 4℃保存；
試劑二：粉劑×2瓶，-20℃保存；
粗酶液提?。?/p>
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟：
（1）在試劑二中加入5mL試劑一充分溶解混勻，置于40℃水浴預熱10min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后24h內用完）；
（2）對照管：在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL樣本和190μL試劑一，混勻，立即記錄333nm處40℃反應30min后的吸光值A1。
（3）測定管：在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL樣本和190μL試劑二，混勻，立即記錄333nm處40℃反應30min后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。每個測定管設一個對照管。
4CL活性計算：
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。
4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=31.75×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位定義：每g組織每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。
4CL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=31.75×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。
4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.063×ΔA
V反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：4-香豆酸輔酶A摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。
4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=63.49×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。
4CL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=63.49×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。
4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.127×ΔA
V反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：4-香豆酸輔酶A摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
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資料/datasheet
