線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒說明書
微量法 100管/96樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
線粒體復(fù)合體Ⅳ又稱細(xì)胞色素C氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞色素C的氧化，并最終把電子傳遞給氧，生成水。
測(cè)定原理：
還原型細(xì)胞色素C在550nm有特征光吸收，線粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞色素C生成氧化型細(xì)胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：液體100mL×1瓶，-20℃保存；
試劑二：液體20mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：液體1.5mL×1瓶，-20℃保存；
試劑四：液體20mL×1瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1支，-20℃保存；
試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
測(cè)定步驟：
（1）工作液的配制：臨用前將試劑五和試劑六依次轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和200μL工作液，混勻，記錄550nm處初始吸光值A(chǔ)1和 37℃反應(yīng)30min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
注意點(diǎn)：
復(fù)合體Ⅳ活力單位的計(jì)算：
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化降解1 nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=19.20×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘催化降解1nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=3.88×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.008×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2.2×10-4 L；ε：細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)，1.91×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化降解1 nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=38.39×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘催化降解1nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=7.76×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.016×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2.2×10-4 L；ε：細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)，1.91×104 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。
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資料/datasheet
