二氫黃酮醇還原酶（Dihydro flavonol reductase，DFR）試劑盒說明書
微量法 100管/48樣
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義
二氫黃酮醇還原酶是類黃酮合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，在決定植物的花色、葉色、果色和其他經(jīng)濟(jì)器官的色澤及其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)方面起著重要作用。
測(cè)定原理
二氫黃酮醇還原酶作用于二氫槲皮素產(chǎn)生兒茶素，可與香草醛縮合形成紅色化合物，在500nm處有特征吸收峰。
需自備的儀器和用品
研缽、低溫離心機(jī)、震蕩儀、氮吹儀、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、水浴鍋、無水乙醇、乙酸乙酯。
試劑組成和配制
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體12mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體1.5mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加2mL蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑四：液體30mL×1瓶，4℃避光保存。
酶液提取
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定操作表
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對(duì)照管 |
測(cè)定管 |
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酶液（μL） |
40 |
40 |
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試劑一（μL） |
140 |
120 |
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試劑二（μL） |
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20 |
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試劑三（μL） |
20 |
20 |
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混勻，30℃反應(yīng)30min |
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乙酸乙酯（μL） |
200 |
200 |
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37℃震蕩10min，取上層溶液，N2吹干 |
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無水乙醇（μL） |
100 |
100 |
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充分震蕩 |
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試劑四(μL) |
300 |
300 |
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混勻，25℃靜置10min，于微量石英比色皿/96孔板中測(cè)定500nm處吸光值A(chǔ)。分別記為A對(duì)照管和A測(cè)定管，△A=A測(cè)定管-A對(duì)照管 |
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酶活性計(jì)算公式
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0184x+0.0002，R2=0.999
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：在30℃，pH7.5條件下，每毫克蛋白每分鐘分解二氫槲皮素產(chǎn)生1mmol兒茶素所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
DFR活性（mmol/min/mg prot）=（△A-0.0002）÷0.0184×V反總÷（V樣×Cpr）÷T÷2
= 9.06×（△A-0.0002）÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：在30℃，pH7.5條件下，每克組織每分鐘分解二氫槲皮素產(chǎn)生1mmol兒茶素所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
DFR活性（mmol/min/g 鮮重）= （△A-0.0002）÷0.0184×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T÷2
= 9.06×（△A-0.0002）÷W
V反總：反應(yīng)總體積，1mL；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min
b．用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0092x+0.0002，R2=0.999
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：在30℃，pH7.5條件下，每毫克蛋白每分鐘分解二氫槲皮素產(chǎn)生1mmol兒茶素所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
DFR活性（mmol/min/mg prot）=（△A-0.0002）÷0.0092×V反總÷（V樣×Cpr）÷T÷2
= 9.06×（△A-0.0002）÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：在30℃，pH7.5條件下，每克組織每分鐘分解二氫槲皮素產(chǎn)生1mmol兒茶素所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
DFR活性（mmol/min/g 鮮重）= （△A-0.0002）÷0.0092×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T÷2
= 9.06×（△A-0.0002）÷W
V反總：反應(yīng)總體積，1mL；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min
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資料/datasheet
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