總巰基測(cè)定試劑盒說明書
微量法100T/48S
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
生物體內(nèi)巰基主要包括谷胱甘肽巰基和蛋白質(zhì)巰基。前者不僅能夠修復(fù)氧化損傷的蛋白質(zhì)，而且參與活性氧清除，后者對(duì)于維持蛋白質(zhì)構(gòu)象具有重要作用。通過測(cè)定總巰基含量和GSH含量，能夠間接測(cè)定蛋白質(zhì)巰基含量。
測(cè)定原理：
巰基基團(tuán)與5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色化合物，在412nm處有最大吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品：
天平、研缽、恒溫水浴鍋、酶標(biāo)儀、96孔板、乙醇和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體18mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體1mL×1管，4℃避光保存。
樣品的制備：
操作步驟：
在96孔板中加入如下試劑
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對(duì)照管 |
測(cè)定管 |
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樣品（μL） |
40 |
40 |
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試劑一（μL） |
150 |
150 |
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試劑二（μL） |
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10 |
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乙醇（μL） |
10 |
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混勻，25℃靜置10min，測(cè)定412nm吸光值。ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。 |
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計(jì)算公式：
總巰基標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.8111x - 0.0037，R2 = 1，x為標(biāo)品濃度，單位μmol/mL，y為吸光度ΔA。
1. 組織：
（1）按樣本重量計(jì)算
總巰基含量（μmol/g 鮮重）=（ΔA+0.0037）÷1.8111×V樣總÷W
=0.552×（ΔA+0.0037）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算
總巰基含量（μmol/mg prot）=（ΔA+0.0037）÷1.8111×V樣總÷Cpr
=0.552×（ΔA+0.0037）÷Cpr
2. 血清、培養(yǎng)液：
總巰基含量（μmol/L）=（ΔA+0.0037）÷1.8111×5×103
=2761×（ΔA+0.0037）
V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g ；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；5：血清，培養(yǎng)液等液體樣本稀釋倍數(shù)；103 ：1mmol/ L=103μmol/ L
注意事項(xiàng)
最低檢出限為10μmol/L。
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