二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）試劑盒說明書
微量法100T/48S
注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
DAO(EC1.4.3.6)廣泛存在于動物（腸粘膜、肺、肝臟、腎臟等）、植物和微生物中。催化多胺氧化為醛，其活性與核酸和蛋白合成密切相關(guān)，能夠反映腸道機械屏障的完整性和受損傷程度。
測定原理：
DAO催化尸胺產(chǎn)生醛和過氧化氫，外源添加過量的辣根過氧化物酶，催化過氧化氫氧化鄰聯(lián)茴香胺生成氧化型鄰聯(lián)茴香胺，在460nm處有特征吸收峰，通過測定該波長吸光度增加速率，計算DAO活性。
自備實驗用品及儀器：
天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體120mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體0.3mL×1支，4℃保存。
試劑二：液體2.5mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：液體1.2mL×1管，4℃保存。
粗酶液提?。?/p>
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。
細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
血清等液體：直接測定。
測定操作表：
1、分光光度計/酶標儀預熱30min，調(diào)節(jié)波長至460nm，蒸餾水調(diào)零。
2、操作表
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對照管 |
測定管 |
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粗酶液（μL） |
50 |
50 |
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提取液（μL） |
128 |
108 |
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試劑一（μL） |
2 |
2 |
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試劑二（μL） |
20 |
20 |
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試劑三（μL） |
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20 |
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混勻，37℃水浴30min，微量石英比色皿/96孔板，蒸餾水調(diào)零，測定460nm吸光值。ΔA=A測定-A對照。 |
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酶活性計算公式：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算：
酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量為一個酶活力單位（U）。
DAO活性（nmol/min/mg prot）= 
×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 18×A460÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算：
酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。
DAO活性（nmol/min/g 鮮重）= 
×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T= 18×A460÷W
（3）按細胞數(shù)量計算：
酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。
DAO活性（nmol/min/104cell）= 
×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數(shù)量）÷T= 18×A460÷細胞數(shù)量
(4) 按液體體積計算
酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。
DAO活性（nmol/min/mL）= 
×V反總÷V樣÷T= 18×A460
ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺毫摩爾消光系數(shù)：7.5 L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應總體積，0.2mL；V樣：反應中樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應時間，30min
b. 用96孔板測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算：
酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量為一個酶活力單位（U）。
DAO活性（nmol/min/mg prot）= 
×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 36×A460÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算：
酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。
DAO活性（nmol/min/g 鮮重）= 
×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T= 36×A460÷W
（3）按細胞數(shù)量計算：
酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。
DAO活性（nmol/min/104cell）= 
×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數(shù)量）÷T= 36×A460÷細胞數(shù)量
(4) 按液體體積計算
酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。
DAO活性（nmol/min/mL）= 
×V反總÷V樣÷T= 36×A460
ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺毫摩爾消光系數(shù)：7.5 L /mmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應總體積，0.2mL；V樣：反應中樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應時間，30min
注意事項：
1、如果OD值小于0.01，適當加大提取用樣本量；OD值大于0.8，粗酶液可適當稀釋，或者減少提取用樣本量。
2、樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測定。
掃描二維碼
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資料/datasheet
