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嗜肺巴斯德桿菌探針法 qPCR 試劑盒
AP9696
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AP9696-50T 50T 50T ¥4490.00 登錄查看
產(chǎn)品詳情

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:嗜肺巴斯德桿菌探針法 qPCR 試劑盒

【產(chǎn)品編號】AP9696

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

產(chǎn)品就是以探針法 qPCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測嗜肺巴斯德桿菌的試

劑盒 。

【檢驗原理】

嗜肺巴斯德桿菌(Pasteurella pneumophila)在自然界中分布廣泛,它有兩

種生物型,主要感染嚙齒類動物,對實驗小鼠、大鼠和豚鼠的危害較大。嗜肺巴斯德

桿菌作為一種條件致病菌,能夠引起免疫缺陷動物或免疫功能低下的動物產(chǎn)生嚴(yán)重的

肺炎,并可能導(dǎo)致動物死亡。

本試劑盒根據(jù)探針法熒光定量 PCR 原理開發(fā)的嗜肺巴斯德桿菌檢測試劑

盒。本產(chǎn)品即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA 模板。引物等組分經(jīng)過優(yōu)化,靈敏

度高。提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品。特異性高,引物是根據(jù)嗜肺巴斯德桿菌

DNA 序列高度保守區(qū)設(shè)計,不會跟其他病毒的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。既可用于定性

檢測,又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5 個數(shù)量級。本產(chǎn)品足

夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。本產(chǎn)品只能用于科研。

【試劑組成】

說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【運輸及保存】

低溫運輸,-20℃保存,保存期限為 12 個月。

【自備試劑】

樣品 DNA。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系

列熒光定量 PCR 檢測儀。

【使用方法】

1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))

稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)。

由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污

染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產(chǎn)品

不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標(biāo)記 6 個離心管,分別為 6,5,4,3,2,1。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同。

3. 在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩 1 分

鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充

分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭,在 4 號管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充

分震蕩 1 分鐘,得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

2. 樣本處理(樣本處理區(qū))

2.1 如果有 N 個樣品,最好設(shè)置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對

照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?10μL 上步所得 4 號稀釋液再加上

一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣,以此作為 PC。

另外用水作為 NC。

2.2 核酸提?。汉怂崽崛】梢圆捎蒙虾嵘鷮崢I(yè)有限公司的核酸提取或純化試劑,操

作方法按照說明書進行。

3.試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

準(zhǔn)備足量的 PCR 管(樣品管、陰性對照管、陽性對照管),向各 qPCR 管中分別

加入下列成分:

4.添加模板(模板添加區(qū))

向 qPCR 管中分別加入 5 uL 模板,順序為陰性對照(DEPC-H2O)、待測樣

品模板、嗜肺巴斯德桿菌 qPCR 陽性對照,離心 30 秒,立即進行擴增反應(yīng)

5.擴增反應(yīng)(擴增及產(chǎn)物分析區(qū)):

將 qPCR 管放置在 qPCR 擴增儀器樣品槽相應(yīng)位置,進行擴增,擴增程序如下

【結(jié)果判定】

1. 如果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,

推算出其濃度。

2. 如果未制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,按照如下標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果:

陽性對照(1×10E5 拷貝/μL)結(jié)果:Ct 值<30,有明顯指數(shù)增長,呈典型的 S 型

曲線。陰性對照結(jié)果:Ct 值>40 或無 Ct 值,無明顯指數(shù)增長期和平臺期。樣本檢

測結(jié)果:Ct 值<38,有明顯指數(shù)增長,表明樣本中檢測出嗜肺巴斯德桿菌,結(jié)果為

陽性;Ct 值>40 或無 Ct 值,表明樣本中未檢測出嗜肺巴斯德桿菌,結(jié)果為陰性;

Ct 值在 38-40 范圍,應(yīng)對樣本進行復(fù)檢,如重復(fù)實驗結(jié)果 Ct 值仍在 38-40 范圍,

有明顯指數(shù)增長,則判定為陽性,否則為陰性。

【注意事項】

1.PCR 操作各階段應(yīng)嚴(yán)格分區(qū)操作,避免交叉污染。

2.試劑盒各組分使用前應(yīng)充分融化混勻,離心數(shù)秒后使用。

3.各組分不得與其他產(chǎn)品或不同批號的相應(yīng)成分進行互換。

4.待測標(biāo)本若不及時檢測,應(yīng)保存于-20℃或-70℃。

5.樣品的處理應(yīng)該嚴(yán)格按照生物安全規(guī)范操作。

6.PCR 操作人員應(yīng)具有經(jīng)驗和受過專業(yè)培訓(xùn)。

7.本試劑盒僅用于科研使用,不做為臨床診斷使用。

 

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