BCA法蛋白含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法100T/96S
正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計(jì)算。此外，可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分析。
測(cè)定原理：
堿性條件下，蛋白質(zhì)中半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、酪氨酸以及肽鍵，能將Cu2+還原成Cu+；2分子的BCA與Cu+結(jié)合，生成紫色絡(luò)合物，在540-595nm有吸收峰，562nm處吸收峰最強(qiáng)。
自備儀器和用品：
臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、移液器和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑A：液體25mL×1瓶，4℃保存。
試劑B：液體0.5mL×1支，4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品：液體2mL×1支，4℃保存。
工作液配制：臨用前請(qǐng)根據(jù)擬用工作液體積（樣本數(shù)×0.2mL），將試劑A和B按照50：1的比例混合，蓋緊后充分混勻。
樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取：
冰浴勻漿，10000rpm，4℃離心10min，取上清，即待測(cè)液。
3. 細(xì)菌、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000rpm，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
測(cè)定操作：
1. 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到562 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 工作液置于60℃水浴預(yù)熱30 min。
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空白管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
測(cè)定管 |
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蒸餾水（μL） |
4 |
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標(biāo)準(zhǔn)品（μL） |
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4 |
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待測(cè)液（μL） |
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4 |
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工作液（μL） |
200 |
200 |
200 |
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混勻后置于60℃保溫30min，于微量玻璃比色皿/96孔板，于562nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)，分別記為A空白管、A標(biāo)準(zhǔn)管、A測(cè)定管。 |
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注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要做一次。
計(jì)算公式：
Cpr (mg/mL)= C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）
=0.5×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）
Cpr (mg/g 鮮重)= C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷ W
=0.5×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷ W
W: 樣本質(zhì)量，g
注意事項(xiàng)：
BCA法蛋白含量測(cè)定試劑盒，適用于測(cè)定蛋白濃度在20-5000μg/ml樣品。測(cè)定前取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，若A測(cè)定管－A空白管﹥1.5，需將樣本用提取液稀釋后再測(cè)定，以確保測(cè)定的準(zhǔn)確性。
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