中性木聚糖酶（Neutral Xylanase，NEX）測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法100T/48S
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物產(chǎn)生，能催化水解木聚糖，也被稱為戊聚糖酶或半纖維素酶，可分解釀造或飼料工業(yè)中的原料細(xì)胞壁以及β-葡聚糖，降低釀造中物料的粘度，促進(jìn)有效物質(zhì)的釋放，以及降低飼料中的非淀粉多糖，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，因而廣泛的應(yīng)用于釀造和飼料工業(yè)中，NEX一般分離自最適生長(zhǎng)pH為6-8的微生物。
測(cè)定原理：
NEX在中性環(huán)境中催化木聚糖降解成還原性寡糖和單糖，在沸水浴條件下進(jìn)一步與3,5-二硝基水楊中發(fā)生顯色反應(yīng)，在540nm處有特征吸收峰，反應(yīng)液顏色的深淺與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)液在540nm吸光值增加速率，可計(jì)算NEX活力。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋，可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑組成和配制：
緩沖液：液體65mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。（若出現(xiàn)白色絮狀或顆粒狀沉淀，可60℃加熱溶解后使用）。
試劑二：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。
粗酶提?。?/p>
測(cè)定操作表：
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對(duì)照管 |
測(cè)定管 |
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樣品（μL） |
60 |
60 |
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緩沖液（μL） |
90 |
90 |
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試劑一（μL） |
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60 |
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試劑二（μL） |
90 |
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混勻，蓋緊瓶蓋，50℃水浴，反應(yīng)30min，立即沸水浴20min滅活。(注意不要讓蓋子爆開(kāi)，以免進(jìn)水，改變了反應(yīng)體系) |
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試劑一（μL） |
60 |
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試劑二（μL） |
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90 |
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混勻，沸水浴顯色5min，取200μL于微量石英比色皿/96孔板中540nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。 |
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NEX計(jì)算公式：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.6904x + 0.0058，R2 = 0.9989
1. 按液體體積活力計(jì)算：
酶活定義：50℃，pH6.0條件下，每毫升液體樣本每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1nmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)中性木聚糖酶的活力單位。
NEX活力（nmol/min/mL）= （ΔA-0.0058）÷1.6904÷150÷T×稀釋倍數(shù)×106
= 657× (ΔA-0.0058)
2. 按蛋白濃度計(jì)算：
酶活定義：50℃，pH6.0條件下，每毫克蛋白每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1nmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)中性木聚糖酶的活力單位。
NEX活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA -0.0058）÷1.6904÷150÷T×稀釋倍數(shù)×106÷Cpr
= 657×(ΔA -0.0058 ) ÷Cpr
3. 按鮮重計(jì)算：
酶活定義：50℃，pH6.0條件下，每克樣本每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1nmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)中性木聚糖酶的活力單位。
NEX活力（nmol/min/g鮮重）= （ΔA -0.0058）÷1.6904÷150÷T×稀釋倍數(shù)×106÷W
= 657×(ΔA -0.0058 ) ÷W
150：木糖的分子量；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；稀釋倍數(shù)=V反總÷V樣=300μL÷60μL=5；
106：轉(zhuǎn)化因子，即1mg/mL=106ng/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.8452x + 0.0058，R2 = 0.9989
1. 按液體體積活力計(jì)算：
酶活定義：50℃，pH6.0條件下，每毫升液體樣本每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1nmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)中性木聚糖酶的活力單位。
NEX活力（nmol/min/mL）= （ΔA-0.0058）÷0.8452÷150÷T×稀釋倍數(shù)×106
= 1315× (ΔA-0.0058)
2. 按蛋白濃度計(jì)算：
酶活定義：50℃，pH6.0條件下，每毫克蛋白每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1nmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)中性木聚糖酶的活力單位。
NEX活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA -0.0058）÷0.8452÷150÷T×稀釋倍數(shù)×106÷Cpr
= 1315×(ΔA -0.0058 ) ÷Cpr
3. 按鮮重計(jì)算：
酶活定義：50℃，pH6.0條件下，每克樣本每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1nmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)中性木聚糖酶的活力單位。
NEX活力（nmol/min/g鮮重）= （ΔA -0.0058）÷0.8452÷150÷T×稀釋倍數(shù)×106÷W
= 1315×(ΔA -0.0058 ) ÷W
150：木糖的分子量；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；稀釋倍數(shù)=V反總÷V樣=300μL÷60μL=5；
106：轉(zhuǎn)化因子，即1mg/mL=106ng/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。
注意事項(xiàng)：
1. 吸光度變化應(yīng)該控制在0.01~0.8之間，否則加大樣品量或稀釋樣品，注意計(jì)算公式中參與計(jì)算的稀釋倍數(shù)要相應(yīng)改變；也可以延長(zhǎng)或者縮短反應(yīng)時(shí)間。
2. 試劑盒2-8℃保存，保質(zhì)期3個(gè)月，建議盡快使用。
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