還原糖含量試劑盒說明書
微量法 100管/48樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
還原糖廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。植物體內(nèi)的還原糖主要包括葡萄糖、果糖和麥芽糖等，是最常見的單糖和雙糖，其中葡萄糖和果糖不僅是呼吸作用的主要底物，也是進(jìn)一步合成蔗糖、淀粉和纖維素的底物。
測(cè)定原理：
加熱促進(jìn)堿性溶液中3,5-二硝基水楊酸溶液與還原糖生成棕紅色氨基化合物，在540nm有特征吸收峰；在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖含量與540nm吸光度成線性關(guān)系，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出樣品中還原糖的量。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：100mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：8mL×1瓶 ，4℃保存；
樣品中還原糖的提?。?/p>
1、細(xì)菌或細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3S，間隔10S，重復(fù)30次），轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中（防止加熱時(shí)水分散失），80℃水浴中40min并且振蕩8~10次，8000g，25℃離心10min，取上清供測(cè)定用。
2、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中（防止加熱時(shí)水分散失），80℃水浴中40min并且振蕩8~10次，8000g 吧，25℃離心10min，取上清供測(cè)定用。
3、血清（漿）的處理：按照血清（漿）體積（mL）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）加入1mL試劑一），冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中（防止加熱時(shí)水分散失），80℃水浴中40min并且振蕩8~10次，8000g，25℃離心10min，取上清供測(cè)定用。
測(cè)定步驟：
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試劑（μL） |
對(duì)照管 |
測(cè)定管 |
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樣本 |
175 |
175 |
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試劑二 |
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125 |
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蒸餾水 |
125 |
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混勻，在95℃水浴中加熱5min（蓋緊，防止水分散失），取出后立即冷卻至室溫，混勻。取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中，540nm波長(zhǎng)下讀取對(duì)照管和測(cè)定管吸光值。計(jì)算ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
注意：如果ΔA大于2，需要將樣本用試劑一稀釋，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)（若顯色后出現(xiàn)分層現(xiàn)象，可改用蒸餾水稀釋）。
還原糖含量計(jì)算：
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 8.3796x- 0.3034；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。
2、按樣本鮮重計(jì)算：
還原糖(μg/g鮮重)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷(W×V1÷V2)=119.34×(ΔA＋0.3034)÷W
3、按樣本蛋白濃度計(jì)算：
還原糖(μg/mg prot)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷(V1×Cpr)=119.34×(ΔA＋0.3034)÷Cpr
4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
還原糖(μg /104 cell)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷（500×V1÷V2）=0.239×(ΔA＋0.3034)
5、按血清（漿）體積計(jì)算：
還原糖(μg/mL)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷（V3×V1÷V2）=1193.4×(ΔA＋0.3034)
1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入樣本體積，0.175mL；V2：加入試劑一體積，1 mL；V3：加入血清（漿體積），0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 4.1898x - 0.3034， R2 = 0.9997；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。
2、按樣本鮮重計(jì)算：
還原糖(μg/g鮮重)＝[1000×(ΔA＋0.3034)÷4.1898×V1]÷(W×V1÷V2)=238.67×(ΔA＋0.3034)÷W
3、按樣本蛋白濃度計(jì)算：
還原糖（μg/mg prot）= [1000×(ΔA＋0.3034)÷4.1898×V1]÷(V1×Cpr)=238.67×(ΔA＋0.3034)÷Cpr
4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
還原糖（μg/104 cell）= [1000×(ΔA＋0.3034)÷4.1898×V1]÷（500×V1÷V2）=0.477×(ΔA＋0.3034)
5、按血清（漿）體積計(jì)算：
還原糖（μg/mL）＝[1000×(ΔA＋0.3034)÷4.1898×V1]÷（V3×V1÷V2）=2386.7×(ΔA＋0.3034)
1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入樣本體積，0.175mL；V2：加入試劑一體積，1 mL；V3：加入血清（漿體積），0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
注意：最低檢測(cè)限為1mg/g鮮重或10μg/mg prot
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