脂肪酸合成酶（FAS）活性試劑盒說明書
微量法 100T/96S
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
FAS是脂肪酸合成關(guān)鍵酶，催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成長(zhǎng)鏈脂肪酸。FAS普遍表達(dá)于各種組織細(xì)胞中，在哺乳動(dòng)物肝、腎、腦、肺和乳腺以及脂肪組織中表達(dá)豐富。
測(cè)定原理：
FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成長(zhǎng)鏈脂肪酸和NADP+；NADPH在340nm有吸收峰，而NADP+沒有；通過測(cè)定340nm 光吸收下降速率，計(jì)算FAS活性。
自備儀器和用品：
研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體100mL×1瓶，－20℃保存。用前1d取出置于4℃充分解凍后混勻。
試劑二：粉劑×1瓶。臨用前加入440μL試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入440μL試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑四：液體20mL×1瓶, 4℃保存。
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入840μL試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
粗酶液提?。?/p>
FAS測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑四置于40℃水浴中預(yù)熱30 min。
3. 在96孔板或EP管中依次加入20μL上清液、4μL試劑二、4μL試劑三、164μL試劑四和8μL試劑五，混勻后于340nm處測(cè)定吸光值，記錄第30s和90s時(shí)吸光值，分別記錄為A1和A2?！鰽測(cè)=A1-A2。
FAS活性計(jì)算：
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(Cpr×V樣)÷T
=1608×△A÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=1608×△A ÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1608×△A ÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：37℃中每毫升樣本每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷V樣÷T
=1608×△A
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr×V樣)÷T
=3216×△A÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=3216×△A÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109)÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=3216×△A÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：37℃中每毫升樣本每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109 )÷V樣÷T
=3216×△A
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。
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資料/datasheet
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