羥脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）試劑盒說明書
微量法100T/96S
注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
HYP是機體膠原蛋白主要成分之一，膠原蛋白大多分布于皮膚、腱、軟骨和血管等，因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項重要指標(biāo)。
測定原理：
樣品經(jīng)水解產(chǎn)生游離的HYP，進一步被氯胺T氧化，氧化產(chǎn)物與對二甲氨基苯甲醛反應(yīng)，產(chǎn)生紅色化合物，在560nm處有特征吸收峰。通過測定樣品水解液560nm吸光值，可計算HYP含量。
自備實驗用品及儀器：
天平、烘箱、玻璃管、離心機、水浴鍋、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、無水乙醇、異丙醇、6mol/L鹽酸和蒸餾水。
試劑組成和配制：
組織提取液：6mol/L鹽酸，自備。濃鹽酸：H2O（V/V）= 1:1，室溫保存。
細(xì)胞提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑二：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。
羥脯氨酸提?。?/p>
測定操作表：
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對照管 |
測定管 |
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樣本（μL） |
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60 |
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試劑一（μL） |
60 |
60 |
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混勻，室溫靜置20min |
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試劑二（μL） |
60 |
60 |
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H2O（μL） |
180 |
120 |
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混勻，60℃，20min，取出后25℃靜置15 min，取200μL于微量石英比色皿/96孔板中檢測560nm處吸光值。ΔA=A測定-A對照 |
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羥脯氨酸含量計算公式：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=64.875x+ 0.0251，R2=0.9991
（1）按樣品重量計算
組織羥脯氨酸含量（mg/g 鮮重）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反總÷(V樣÷V樣總×W)
= 0.154×（ΔA-0.0251）÷W
（2）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
細(xì)胞羥脯氨酸含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）= 0.077×（ΔA-0.0251）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬個）
（3）按血清體積計算
HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷ 64.875×V反總÷V樣×2
=0.154×（ΔA-0.0251）
V反總：反應(yīng)總體積，0.3 mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.06mL；V樣總：加入提取液體積， mL；W：樣本重量，g
b.用96孔板測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=32.4375x+ 0.0251，R2=0.9991
（1）按樣品重量計算
HYP含量（mg/g 鮮重）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷(V樣÷V樣總×W)
= 0.308×（ΔA-0.0251）÷W
（2）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
HYP含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）= 0.154×（ΔA-0.0251）÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）
（3）按血清體積計算
HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷V樣×2
= 0.308×（ΔA-0.0251）
V反總：反應(yīng)總體積，0.3 mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.06mL；V樣總：加入提取液體積， mL；W：樣本重量，g；2，血清吹干后復(fù)溶的倍數(shù)。
注意事項：
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資料/datasheet
