PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈式反應，又稱體外DNA擴增技術可以將微量目的DNA片段擴增一百萬倍以上。PCR的原理在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。
PCR引物設計的基本原則包括：
1. 引物長度：
1) 通常在1530個堿基對（bp）之間，理想長度為1827bp。
2) 過長的引物可能導致延伸溫度過高，不適合Taq DNA聚合酶的反應條件。
2. GC含量：
1) 40%60%之間，以4555%為佳，確保復性條件最佳。
2) 上下游引物的GC含量和Tm值應接近。
3. Tm值：
1) 引物的Tm值應在5580℃之間，理想為72℃左右，以保證復性效率。
2) 正向和反向引物的Tm值相差不超過5℃。
4. 3'端特性：
1) 3'端堿基一般不使用A，因為A可能增加錯誤引發(fā)的機率。
2) 3'端避免出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基（如GGG或CCC）。
3) 3'端的ΔG值應較低，絕對值不超過9，以減少錯配引發(fā)。
5. 引物結構：
1) 避免引物內部或兩引物之間的互補，尤其是3'端的互補。
2) 3'端不應形成發(fā)夾結構或二聚體，這些結構可能干擾引物與模板的結合。
3) 引物的ΔG值最好呈正弦曲線，3'端較低，中間和5'端相對較高。
6. 特異性：
1) 引物不應與非特異擴增序列有超過70%的同源性，且避免連續(xù)8個堿基的互補。
2) 引物應在核酸保守區(qū)內設計，并確保引物與模板的特異性。
7. 5'端修飾：
5'端可以修飾以引入限制酶位點、突變位點、標記物等。
8. 堿基分布：
1) 引物序列中堿基分布應隨機，避免聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
2) 引物自身不應有連續(xù)4個堿基的互補，以免形成發(fā)夾結構。
9. 產物大小：
特別對于實時熒光定量PCR（qPCR），產物大小通常限制在80250bp之間。
10. 其他注意事項：
1) 避免3'端與模板的多個位點互補，防止非特異性擴增。
2) 在設計引物時，應考慮引物二聚體的形成，并盡量避免。
3) 對于RTqPCR，引物應設計在編碼區(qū)外顯子上，避免內含子。
遵循這些原則，可以提高PCR反應的效率和特異性，確保實驗的成功。
設計引物所要考慮注意事項:
1．酶切位點
兩個酶切位點應是載體上的，所連接片斷上沒有這兩個位點，且距離不能太近，否則往往導致兩個酶都切不好。因此，兩個酶切位點要緊挨在一起，只能切一個，除非恰好是與上面兩個酶在一起的酶切位點，最好隔四個核苷酸。且不能有堿基的交叉，比如AGATCTTAAG，這樣的位點比較難切。
2．酶的選擇
最好使用雙酶切效率高的，但兩個酶切點最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補），否則效果相當于單酶切，最好使用具有共同buffer，且較常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），這樣可以省錢。
3．Tm的計算
Tm是由互補的DNA區(qū)域決定的，而不互補的區(qū)域對DNA的溶解是沒有作用的。因此，對于引物的Tm，只有和模板互補的區(qū)域對Tm才有貢獻。計算Tm時，只計算互補的區(qū)域（除非你的酶切位點也與模板互補）。設計引物的時候，先不管5'端的修飾序列，把互補區(qū)的Tm控制在55度以上（我喜歡控制在58以上，具體根據PCR的具體情況，對于困難的PCR，需要適當提高Tm），再加上酶切位點和保護堿基，這樣的引物通常都是可用的，即使有小的問題，也可以挽回。
Tm溫度高的引物就比較容易克服3’發(fā)卡、二聚體及3'非特異結合等問題。簡單的計算公式可以用2+4的公式。若你計算的Tm值達到了快90 ，不包括酶切位點。引物公司給你發(fā)的單子是包括酶切位點的。自己可以再估計一下。如你設計了帶酶切位點的引物，總長分別為29、33個堿基，去掉酶切位點和保護堿基，分別為17、21個堿基。引物公司給的單子是70多度，實際用的只有50度，用55度擴的結果也差不多。
其它關于Tm值的計算，有用PP5.0進行評價的，需要考慮base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer等參數。
4．退火溫度
退一般退火溫度為Tm-5度，退火溫度的計算可以不把加入的酶切位點及保護堿基考慮進去， PCR幾個循環(huán)后，引物外側的序列已經參入了擴增片斷中，所以你可以在預變性后多加幾步，溫度比你Tm值低些（這樣可能會增加非特異性），Tm值是你包括酶切位點及保護堿基的Primer計算出來的。
5．5’端保護堿基
一般在5'端加保護堿基,如果你擴增后把目的條帶做膠回收轉入T-VECTOR或者其它的載體的話,酶切時可以不需加保護堿基
6．引物二聚體
關于引物二聚體，最好用primer或是其他設計引物的軟件進行計算一下，看看引物之間的△G（自由能）的絕對值，如果小于10，一般是問題的。如果稍大，PCR時可以提高一下退火溫度，一般是沒有問題的。如果3’端形成二聚體，并且自由能絕對值較大，如果 PCR沒有條帶，建議重新設計引物。此外，所加的三個核苷酸的保護序列經過盡心設計有時也可以降低二聚體的△G。
7．引物的設計
在設計酶切位點時，最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。這是因為，一個特異性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位點序列和保護性堿基，大致就是28bp左右了。而我們在設計退火溫度時，與引物的長度有關，比正常的引物(20bp) 的Tm肯定要高一些。如果我們能利用引物自身的部分序列，就可以有效地減少引物的長度。
還有，有些酶是離不開末端序列的，因此，在設計一個酶位點時，最好把該酶的性質弄清楚。設計時限制性酶切位點是應該在5’端的頂端。在設計引物時，常在5’端添加酶切位點，以利于PCR產物連接到載體。
設計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。先用軟件設計出合適的引物，引物的3’端是引發(fā)延伸的起點，因此一定要與模板準確配對，應盡量避免在引物3’端的第一位堿基是A（容易錯配）。引物3’端最佳堿基的選擇是G和C，因為他們形成的堿基配對比較穩(wěn)定，目的序列上并不存在的。
